인간 합성 항체 파지디스플레이 라이브러리를 통한 SARS-CoV-2 중화항체 발굴

▷ 기술소개(Introduction)

    -  인간 합성 항체 파지디스플레이 라이브러리를 통한 항원 특이적 인간 항체의 선별과 특성 분석을 통해 SARS-CoV-2

       중화 항체 선별하는 기술입니다.

▷ 기술의 장점

 

    -  바이러스로 감염된 인간 혈액 검체를 사용하지 않고, 정제된 바이러스 항원을 인간 합성 항체 라이브러리 스크리닝

    -  높은 친화도와 우수한 물성을 가진 바이러스 특이적 인간 항체를 단기간에 발굴할 수 있음

    -  정제된 바이러스 항원을 이용하기 때문에 고위험성 바이러스를 위한 시설( BSL-3)이 필요하지 않음

   - 인간 면역세포(B세포 및 T세포)와 무관한 항체 스크리닝 방법으로 새로운 바이러스 항원 에피토프를 

     인지하는 인간 항체 선별이 가능

▷ 기술 요약(Summary)

    -  신약개발지원센터 인간 합성 항체 파지디스플레이 라이브러리로부터 SARS-CoV-2 스파이크

    -  수용체 결합 도메인 (S-RBD) 에 결합하는 인간 Fab 항체의 선별

    -  S-RBD 결합 인간 Fab 항체의 생산 및 affinity 분석

    -  S-RBD 결합 인간 Fab 항체의 ELISA 및 세포기반 중화능 분석 

    -  S-RBD 결합 인간 IgG 항체의 생산 및 물성분석 

▷ 세부기술 소개

 ⊙ 세부기술 1.  인간 합성 Fab 항체 파지디스플레이 라이브러리 패닝

  ○  신약개발지원센터 인간 합성 항체 라이브러리

    -  2종의 Fab 및 1종의 scFv 항체라이브러리 구축 (각각 ~1x1010 라이브러리 사이즈)

   - HTS 자동화장비 구축 (콜로니 피커 등)

   - 선별된 항체의 우수한 물성 (affinity, aggregation, stability 등) 확인

 

  ○  인간 합성 항체 라이브러리 패닝을 통한 S-RBD 결합 인간 항체 발굴 개요

    -  S-RBD 에 대한 인간 합성 Fab 항체 라이브러리의 파지 패닝

    -  phage ELISA 및 DNA 서열분석에 의한 항원 특이적 S-RBD Fab 항체 클론 선별

    -  S-RBD Fab 항체의 대장균 발현 및 affinity 컬럼 정제를 통한 생산

    -  S-RBD Fab 항체의 affinity 및 중화능 분석

    -  S-RBD IgG 항체의 생산 및 특성분석

  ○   인간 합성 Fab 항체 라이브러리 패닝

    -  S-RBD 에 대한 인간 합성 Fab 항체 라이브러리의 파지 패닝(4라운드)

    -  phage titer 및 polyclonal phage ELISA 에 의한 패닝 라운드 별 S-RBD 결합 항체의 enrichment 확인

    -  monoclonal phage ELISA 및 DNA 서열분석에 의한 S-RBD 특이적 항체의 선별 (10 종, HCDR3 길이가 12 아미노산

       이상인 클론이 90%)

    -  Phage ELISA 에 의한 선별된 10종의 S-RBD Fab 항체의 whole S1 단백질 및 S-RBD 변이체에 대한 결합 확인

 ⊙ 세부기술 2.  S-RBD 결합 인간 Fab 항체 생산 및 affinity 분석

  ○  S-RBD 결합 인간 Fab 항체의 생산

 

    -  10종의 S-RBD Fab 항체의 대장균 발현

    -  발현된 S-RBD Fab 항체 단백질의 affinity 컬럼 정제

    -  정제된 S-RBD Fab 항체 단백질의 SDS-PAGE 분석

  ○  S-RBD 결합 인간 Fab 항체의 특이성 분석

    -  ELISA를 이용한 10종의 S-RBD Fab 항체의 active S1 trimer에 대한 결합 분석 (10종 모두 active S1 trimer에 결합 확인)

    -  ELISA를 이용한 10종의 S-RBD Fab 항체의 SARS-CoV 및 MERS-CoV 의 S1 에 대한 결합 분석(10종 중에 7종이 SARS-CoV-2 에 

       특이적으로 결합함을 확인 (3종 (E4, E10, G3) 은 SARS-CoV 와 교차 결합함). 10종 모두 MERS-CoV 에는 결합하지 않음)

  ○  S-RBD 결합 인간 Fab 항체의 affinity 분석

 

   -  ELISA를 이용한 10종의 S-RBD Fab 항체의 S-RBD 에 대한 affinity (EC50) 분석 (100 nM ~ 663 nM 의 affinity 범위를 확인)

 ⊙ 세부기술3.  S-RBD 결합 인간 Fab 항체의 중화능 분석

  ○   ELISA를 이용한 중화능 분석

    -  고정된 S-RBD 에 대한 10종의 S-RBD Fab항체와 biotinylated ACE2 (S-RBD 수용체) 사이의 경쟁적 결합(competitive binding)을

        ELISA 로 분석함으로서 중화능을 확인(positive 중화항체와 거의 유사한 수준으로 5종의 S-RBD Fab 항체가 S-RBD 와

        ACE2 사이의 결합을 억제함을 확인)

  ○  ACE2 과발현 세포주를 이용한 중화능 분석

    -  ACE2 수용체가 과발현된 세포주 (Calu-3)에 대한 10종의 S-RBD Fab 항체와 S-RBD사이의 경쟁적 결합(competitive binding)을

     flow cytometry로 분석함으로서 중화능을 확인 (ELISA에 의해 중화능이 확인된 5종의 S-RBD Fab 항체가 positive

  중화항체와 거의 유사한 수준으로 S-RBD 와 세포표면의 ACE2 사이의 결합을 억제함을 확인)

 ⊙ 세부기술 4. S-RBD 결합 인간 IgG 항체 생산 및 물성분석

  ○  S-RBD 결합 인간 IgG 항체의 생산

    -  중화능이 확인된 S-RBD IgG 항체의 HEK293 세포주 일시발현

    -  발현된 S-RBD IgG 항체 단백질의 affinity 컬럼 정제

    -  정제된 S-RBD IgG 항체 단백질의 SDS-PAGE 분석

  ○  S-RBD 결합 인간 IgG 항체의 특성분석

    -  정제된 S-RBD IgG 항체의 특성 분석(ELISA 및 SPR에 의한 affinity 분석, SEC 분석, 및 thermal stability 분석)

▷ 적용사례

    

 ⊙ 메르스코로나바이러스 특이적 인간 항체 발굴

  (Kim et al., antibodies 2019, 8, 42; doi:10.3390/ antib8030042)

    -  메르스 코로나바이러스 스파이크 S2 도메인 (MERS-S2) 에 대한 인간 합성 Fab 항체 라이브러리 패닝

    -  3종의 MERS-S2 Fab 항체의 생산 및 특성 분석 (affinity, SEC, Thermal stability)

    -  3종의 MERS-S2 IgG 항체의 생산 및 특성분석 (affinity, SEC, Thermal stability, immunofluoresence)

    -  3종의 MERS-S2 IgG 항체의 바이러스 중화능 시험 (중화능은 없음을 확인)

    -  ㈜ 플렉센스의 ACCEL ELISA를 이용한 sandwich ELISA 로 메르스 코로나바이러스 진단제로서의 가능성 확인

 ⊙ YKL-40 표적 인간 항체치료제 개발

    (Kang et al., Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6354; doi:10.3390/ijms21176354)

    -  인간 YKL-40 에 대한 인간 합성 Fab 항체 라이브러리 패닝

    -  8종의 인간 YKL-40 Fab 항체 선별

    -  8종의 인간 YKL-40 Fab 항체의 생산 및 특성 분석 (affinity, SEC, Thermal stability)

    -  6종의 인간 YKL-40 IgG 항체의 생산 및 특성분석 (affinity, SEC, Thermal stability, immunofluoresence)

    -  6종의 인간 YKL-40 IgG 항체의 in vitro cell migration 분석 (3종의 후보 선별)

    -  3종의 인간 YKL-40 IgG 항체의 in vivo cell migration 및 tumor growth 분석 (1종의 후보 선별)

 ⊙ 세포유전자치료제 (CAR-T/-NK) 개발을 위한 인간 scFv 항체 발굴

    -  인간 CD19 등 다양한 항암 바이오마커에 대한 인간 합성 scFv 항체 라이브러리 패닝을 통해 CAR-T 및 CAR-NK 제작

    -  제작된 CAR-T 및 CAR-NK 의 효능 분석

 ⊙ 세포기반 항체 라이브러리 패닝을 통한 막단백질 특이적 항체 발굴

    -  바이오마커 과발현 세포주에 대한 인간 합성 항체 라이브러리 패닝을 통한 막단백질 특이적 인간 항체 발굴 기술

    -  정제된 막단백질의 ectodomain 에 대한 ELISA 및 flow cutometry 에 의한 세포결합 분석으로 특이성 확인 

▷ 적용분야

    -  질환 타깃 단백질에 대한 후보 항체 발굴

    -  파지디스플레이 기술을 통한 항체의 항원 친화도 및 물성 개선 (affinity maturation, stability & solubility 엔지니어링)

▷ 참고문헌

    -  Barbas III et al., Phage Display: A Laboratory Manual, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press

    -  Kim et al., Selection and characterization of monoclonal antibodies targeting Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus through a human

  synthetic Fab phage display library panning, antibodies 2019, 8, 42; doi:10.3390/antib8030042

    -  Kang et al., Selection and characterization of YKL-40-targeting monoclonal antibodies from human synthetic Fab phage display libraries, 

     Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6354; doi:10.3390/ijms21176354

▷ 기술 담당자(문의)

• 최적화지원부 담당자: 최원석 부장(043-200-9510) wschoi@kbiohealth.kr
• 항체의약품팀 담당자: 김대영 팀장(043-200-9521) kimdae@kbiohealth.kr