바이오의약품 면역원성 관련 통합 분석 기술

1. 개요

 신약약효평가지원부는 바이오의약품의 유효성, 안전성, 약동/약력학적 평가와 다양한 평가의 신뢰성보증 업무를 지원하고 있으며, 이번에는 바이오의약품의 유효성, 안전성, 약동/약력학적 결과 전반에 영향을 줄 수 있는 면역원성 관련 평가 기술에 대해 좀 더 자세히 소개하고자 합니다.
 항체, 재조합단백질과 같은 고분자 바이오의약품은 생체 내에 투여 되었을 때 면역시스템의 면역원 (immunogen)으로 작용하여 세포성 (cellular) 혹은 항체를 생성하는 체액성 (humoral) 면역반응을 유도할 수 있다. 바이오의약품에 대한 면역반응은 백신에 대한 항체 생성과 같이 의도된 면역 반응과 항약물항체 (anti-drug antibodies, ADAs) 생성과 같이 의도하지 않은 면역반응으로 나눌 수 있습니다.
백신과 같이 의도된 면역반응의 경우, 충분한 면역반응이 유도될 수 있도록 적합한 항원을 선별하는 것이 매우 중요하다. 반면, 항약물항체와 같이 의도하지 않은 면역반응은 최소화할 수 있도록 약물이 디자인되어야 합니다.
 바이오의약품이 생체 내로 투여 되었을 때 예상되는 면역반응은 in silico 혹은 in vitro 면역원성 평가 시스템을 통해 예측할 수 있습니다. 바이오의약품에 의해 생성된 항약물항체는 항원-항체 반응을 이용한 Enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) 혹은 MSD (Meso scale discovery) 장비를 사용한 electrochemiluminescent assay를 통해 정량적 분석이 가능하며, 세포기반 (cell-based)의 중화 활성 (neutralizing activity) 평가를 통해 항약물항체가 약효에 미칠 영향을 평가할 수 있습니다.

2. 관련 기술

 A. In silico 면역원성 평가 기술

  In silico 면역원성 평가는 Immune Epitope Database (IEDB)를 기반으로 하고 있다. IEDB는 인간, 비인간영장류 및 기타 동물 연구를 통해 실험적으로 도출된 항체와 T 세포 epitope 데이터이다. In silico 면역원성 평가는 바이오의약품의 아미노산 서열을 IEDB와 비교 분석하고, 물리화학적 특성과 사람의 HLA type 등을 종합적으로 고려하여 면역원성 유발 가능성을 예측합니다. In silico 면역원성 분석은MHC I/II에 결합하는 CD8+/CD4+ T cell epitope은 물론 B cell receptor (BCR) epitope, 면역활성 epitope (Th1/Th2)에 대한 예측 정보를 제공하며, 바이오의약품의 단백질 서열에 존재하는 epitope이 항원제시세포 (antigen presenting cell, APC)의 MHC I 혹은 II에 얼마나 잘 결합할 수 있는 구조인가를 통해 예측 하지만, 바이오의약품에 대한 항체가 만들어지기 위해서는 항원제시세포의 MHC I 혹은 II에 대한 결합뿐만 아니라 MHC I/II-antigen complex를 인식하는 TCR (T cell receptor)을 가진 helper T 세포가 존재하여야 하며, 활성화된 T 세포에 의해 동일한 항원을 제시하는 B 세포가 활성화되어야 합니다. In silico 면역원성 예측은 이러한 일련의 반응이 고려되지 않아 실제 면역반응에 비해 overprediction되는 경향이 있으므로, in silico 면역원성 평가에서 문제가 될 것으로 예측되는 경우, in vitro 면역원성 평가를 통한 검증이 필요합니다.

 

 B. In vitro 면역원성 평가 기술
  In vitro 면역원성 평가법은 사람의 말초혈액단핵구(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)나 PBMC로부터 분화시킨 수지상세포 (Dendritic cells, DC)와 T 세포를 사용하여 T 세포의 증식이나 활성화에 의한 IFNγ, IL-2와 같은 cytokine 분석을 통해 임상에서의 면역원성 유발 가능성을 예측하는 방법입니다.

  i. DC:T 세포 기반의 면역원성 분석법
   PBMC로부터 분리한 monocyte를 DC로 분화시킨 후, immature 상태의 DC에 항원을 처리한 후 CD8+ 혹은 CD4+ T 세포와 같이 배양하여 T 세포의 증식이나 활성화된 T 세포가 분비하는 cytokines을 분석하여 면역원성 유발 가능성을 평가한다. T 세포의 증식은 형광으로 표지한 T 세포를 Flow cytometry (FACS)를 사용하여 분석하며, cytokine은 고감도 장비인 MSD를 사용한 electrochemiluminesce 방법으로 정량적으로 비교 평가합니다. 이 분석법은 분리 정제된 세포를 사용함으로써 면역원성의 차이를 보다 정밀하게 평가할 수 있어 여러 개의 후보물질을 비교평가하여 최적의 후보물질을 선별하는 목적으로 사용될 수 있습니다.

 

  ii. PBMC 기반의 면역원성 분석법
  다양한 항원제시세포와 T 세포가 포함된 PBMC에 시험물질 (면역원)을 직접 처리한 후, 활성화된 면역세포가 분비하는 다양한 cytokine을 MSD 사용한 다중 분석법으로 정량적인 비교 분석함으로써 면역 활성화 정도를 평가할 수 있을 뿐만 아니라 cytokine의 종류에 따라 면역 활성화 경향(Th1/Th2)도 분석이 가능합니다. 이 분석법은 APC와 T 세포를 분리하여 비교할 필요가 없거나, 시험 물질에 의한 포괄적인 면역 활성화 정도를 평가하는 목적으로 사용될 수 있습니다.

 

 C. ADA 평가 기술
  ADA는 바이오의약품에 존재하는 다양한 epitope에 대해 만들어질 수 있습니다. ADA의 결합 부위에 따라 아무런 영향이 없거나, 약효 및 독성은 물론 약동/약력학에도 영향을 줄 수도 있습니다. 따라서, ADA는 생성 유무를 확인하는 것뿐만 아니라, 바이오의약품의 활성 부위와 결합하여 효능을 상쇄시키는지 중화 활성 분석을 통해 평가하여야 합니다.

  i. MSD 기반의 ADA 정량 분석법
  ADA는 ELISA 기반으로 분석이 가능하지만, MSD 기반의 고감도 분석법을 사용할 경우, 다양한 농도로 존재하는 ADA를 보다 폭넓게 분석이 가능합니다. ADA는 인간의 면역 시스템을 재구성한 인간화 마우스를 사용하여 평가가 가능하지만, 인간화의 정도에 따라 바이오의약품에 대한 평가 결과의 임상 예측 정도는 제한적입니다. 임상시험검체는 식약처 지정 임상시험검체분석기관을 통해서만 분석이 가능한데, 신약개발지원센터는 임상시험검체분석기관으로 지정(2020.3)되어 있어 GCLP (Good clinical laboratory practice) 기준에 따라 운영되는 분석실을 통해 ADA 분석 지원이 가능합니다.

 

  ii. 세포 기반의 중화능 분석법
   항체 또는 재조합 단백질 기반의 바이오의약품은 세포 외부로 분비된 단백질 또는 세포 표면에 존재하는 막단백질을 표적으로 합니다. 성장호르몬이나 cytokine과 같은 분비 단백질의약품의 경우 이들이 결합하는 표적 단백질을 발현하는 세포주를 사용하여 중화 활성을 평가할 수 있고, 막단백질을 표적으로 하는 의약품의 경우에도 막단백질을 발현하는 세포주를 사용하여 막단백질이 가지는 활성의 중화 여부를 통해 중화능 평가를 할 수 있습니다.

 
 

3. 관련 기술 응용 분야

 A. 바이오의약품에 대한 면역원성 예측

  i. 바이오의약품의 임상 면역원성 예측
  ii. 면역원성 비교 평가를 통한 최적의 후보물질 선별
  iii. 면역원성 평가를 통한 최적 백신 항원 선별
  iv. 면역증강제 (adjuvant)의 면역활성 평가

 B. 바이오의약품에 대한 ADA 및 중화능 평가
  i. 비임상/임상시험 검체 내 ADA의 정량적 분석
  ii. 세포주 기반의 ADA 중화능 평가법 개발 및 평가

 C. 바이오의약품 면역원성 및 ADA 평가 컨설팅
  i. 바이오의약품 면역원성 및 ADA 평가법 개발 및 평가 컨설팅
  ii. 면역원성 관점의 바이오의약품 개발 전략 컨설팅