- 작성자오대균
- 작성일시2021.05.21 12:36
- 조회수5,396
바이오의약품 생산성 향상을 위한 신호 펩타이드 (Signal Petide) 최적화 기술
1. 개요
신약개발지원센터 최적화지원부 단백질의약품팀에서는 바이오의약품 후보물질의 최적화를 위한 핵심 플랫폼 기술을 확보하고 이를 토대로 바이오의약품 개발을 지원하고 있습니다.
핵심 플랫폼 기술을 이용한 지원분야는 크게 2가지로 나눌 수 있습니다. 첫 번째는 비 인간 유래 항체의 인간화 기술과 Fc 공학을 통한 혈중 반감기 증대 Fc 변이체 (국내, PCT 특허 등록 완료)를 확보하고 이를 이용한 항체 최적화를 지원하고 있습니다. 두 번째는 난발현 단백질(Difficult to Express Protein, DtEP)의 발현 개선을 위한 단백질 구조분석 기반의 포유동물세포 및 박테리아에서의 최적 발현 시스템과, 생산성 향상을 위한 동물세포 발현용 신호 펩타이드 1,200 종 및 바코드 서열을 이용한 최적 신호 펩타이드 초고속 선별 시스템(국내, PCT 출원 완료)을 통해 단백질 발현 최적화를 지원하고 있습니다.
이번 호에서는 핵심 플랫폼 기술 중 단백질 발현 최적화, 기술에 대해 자세히 소개하고자 합니다. 단백질 발현 최적화 기술은 ‘바이오의약품 및 재조합 단백질 생산성 향상’을 위한 초기 최적화 기술입니다. 항체를 포함한 바이오의약품 후보물질과 표적 단백질의 낮은 생산성 문제를 해결하기 위해 개발upstream
단계인 신호 펩타이드 (signal peptide) 최적화를 통해 고품질의 재조합 단백질을 다량으로 확보하기 위해 개발된 플랫폼 기술입니다.
[그림 1] 단백질 합성 과정과 신호 펩타이드 절단
신호 펩타이드는 세포 내에서 단백질이 만들어질 때 N 말단에 존재하는 짧은 아미노산 서열로, 신호 서열 (signal sequence)로도 불리며, 주로 아미노산 15~30개로
이루어집니다(그림 1).
[그림 2] 바이오 의약품 생산에 이용되는 단백질 분비 경로
신호 펩타이드를 가진 단백질은 분비 경로 (secretory pathway)에 있는 특정 세포 소기관(소포체(Endoplasmic Reticulum) 골지체(Golgi apparatus), 엔도좀(Endosome,), 세포막(Plsama membrane) 등)으로 가거나 세포 밖으로 분비됩니다. 이러한 신호 펩타이드는 단백질의 종류마다 아주 다양하여 진핵 생물 (Eukaryote)에서만 4,000여 종이 보고 되어 있고, 단백질의 위치와 발현량을 결정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다(그림 3).
[그림 3] 진핵생물에서 알려진 신호 펩타이드 정보
재조합 단백질 발현 시 사용하는 신호 펩타이드의 종류에 따라 세포 외 분비율이 달라질 수 있어신호 펩타이드 최적화를 통해 발현하고자 하는 단백질의
세포 외 분비를 증가시킨 사례들이 활발히 보고되고 있습니다 (Acta Biochim Biophys Sin(2011); Biochem Biophys Res Commun. (2010)). 따라서, 단백질
의약품 개발 시 수 천개의 신호 펩타이드 중 목적 단백질 발현에 가장 적합한 것을 선별하여 도입한다면 재조합 단백질 의약품의 생산량을 극대화
할 수 있습니다.
실제로, Bayer사에선 단백질 발현에 필요한 elements들을 module 형식으로 도입하여 단백질 발현을 최적화 하는 MoPET (Modular protein Expression Toolboxes) 시스템을 개발하여 재조합 단백질발현량을 60배 정도 높인 사례가 보고되었으며 (Plos One (2017), 이를 파이프라인 개발에 적극적으로 도입하고 있습니다.
대부분의 단백질 의약품은 동물세포에서 세포 밖으로 분비시켜 생산하고 있는데, 이때 신호 펩타이드와 의약 단백질과의 조합에 따라 생산성이 크게
달라집니다.
본 플랫폼 기술은 각 재조합단백질의약품 혹은 표적 단백질에 최적화된 신호 펩타이드를 초고속으로 선별하여 적용함으로써 생산성을 획기적으로
향상시킬 수 있습니다.
2. 신호 펩타이드 초고속 선별 플랫폼 기술 소개
A. 기술 원리
- 다양한 신호 펩타이드 중 발현하고자 하는 단백질에 최적화된 신호 펩타이드를 효율적으로 선별하기 위해 목적 단백질을 1,200 종의 인간 신호
펩타이드와 그에 상응하는 바코드로 표지하고, 단백질에 표지된 바코드를 LC/MS를 통해 정량적으로 분석함으로써 초고속으로 최적의 신호
펩타이드를 탐색하는 기술을 구축 하였습니다.
[그림 4] 바코드 기반의 신호 펩타이드 선별 기술 원리
- 신호 펩타이드는 단백질이 분비되는 과정에 소포체 (ER)에서 절단되어 제거되기 때문에 분비된 단백질로부터는 신호 펩타이드 서열을 알 수 없습니다.
이를 보완하기 위해 각 단백질의 C-말단에 바코드를 표지하고 이를 질량분석기를 이용해 동정함으로써 각 바코드에 해당하는 신호 펩타이드를
역추적하여 선별하는 기술을 고안하였습니다.
B. 신호 펩타이드 초고속 선별 기술 Work flow
i. 표적 단백질 라이브러리 구축
- 표적 단백질을 1,200 종의 인간 신호 펩타이드-바코드 라이브러리 벡터에 삽입하여 신호 펩타이드 선별을 위한 표적 단백질 라이브러리를
제작하였습니다.
[그림 5] 신호 펩타이드 초고속 선별 기술 Work Flow
ⅱ. 표적 단백질 라이브러리 발현 및 질량 분석기 시료 제작
- 구축된 표적 단백질 발현 벡터 라이브러리를 동물세포에서 발현시켜 표적 단백질 시료를 확보합니다. 이때 신호 펩타이드의 종류에 따라 분비되는
단백질의 양이 달라지는데, 단백질의 양적 차이를 결정하는 해당 신호 펩타이드는 바코드 서열 분석을 통해 구분될 수 있습니다.
ⅲ. 유효 신호 펩타이드 선별
- 발현된 표적 단백질은 질량분석기를 사용하여 C-말단에 표지된 바코드를 동정하고 정량적으로 분석합니다. 발현량에 따라 해당 바코드의 순위를
결정하고, 바코드에 해당하는 신호 펩타이드를 역추적함으로써 단백질 생산량을 증가시키는 유효 신호 펩타이드를 선별 할 수 있습니다.