뉴스레터 5월호

 

바이오 의약품 개발을 위한 Octet 장비 활용 분석 기술

 

1. 기술의 개요

Octet은 생물층 간섭계 (BLI, Bio-layer interferometry)를 사용하여 형광 표지 없이 (label free) 실시간으로 생물 분자들간의 상호 작용을 분석하는 광학 바이오 센싱 기술을 사용하는 장비입니다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR, Surface Plasmon Resonance) 방식의 장비와 함께 항체의약품을 비롯한 바이오 의약품의 분석에 널리 사용되고 있습니다. Octet은 “Dip and Read” 형식을 활용하여 기존 프로세스보다 짧은 시간에 다수의 결합력 및 정량 분석이 가능한 high throughput 장비이며, 바이오센서 팁을 샘플이 담겨진 96-well 혹은 384-well plate의 지정구간으로 직접 이동시키면서 샘플간 상호작용 분석하는 반자동화 시스템입니다.

Octet은 바이오센서에 분자가 결합 또는 해리되는 반응으로 생기는 간섭패턴을 통해 분자상호 작용을 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 먼저 리간드 (Ligand)를 바이오센서에 고정한 후 순차적으로 표적 분자 (Analyte)가 포함된 분석물을 결합시켜 센서 표면 상단에 층을 생성하게 합니다. 이를 텅스텐 램프의 백색광으로 비추게 되면 센서 표면으로부터 두 개의 분석물이 결합된 층과 그렇지 않은 층 간에 강도가 다른 두 가지 고유한 반사 패턴을 생성하게 됩니다. 그림 1에서 보는 것과 같이 이 두 반사 패턴의 차이는 파장 이동 (Δλ)으로 표시되며, 이를 이용하여 샘플 간의 결합과 해리 정도를 정량화하여 상호작용을 분석할 수 있습니다.

그림 1. 바이오센서 팁과 Biolayer interferometry (BLI) 기술

Octet은 BLI 방식의 기술을 사용하는 대표적인 분석 장비입니다. 신약개발지원센터는 고속탐색 (16 채널 동시 분석가능)이 가능한 OctetQK384 시스템을 구축하고 있으며, 바이오 의약품 개발 과정에서 단백질 배양액의 정량 분석, 분자들간의 결합력 분석, 등의 기술서비스를 지원하고 있습니다.  

 

※ Sartorius사로 인수되어 모델명이 R series(R8, R16 etc.)로 변경됨.

그림 2. Octet 장비모델

 

1. Octet 장비를 활용한 바이오 의약품 개발 사례

바이오 의약품 개발은 작용기전 (MOA) 연구를 통해 확인된 질병 타겟을 효과적으로 제어할 수 있는 후보물질을 발굴하고 최적화하는 과정으로, 초기 물질을 탐색하고 특성을 분석하는 데 오랜 시간과 많은 비용이 들어갑니다. Octet 장비는 고속으로 후보물질의 특성을 분석함으로써 개발 과정에 소요되는 시간과 노력을 최소화할 수 있습니다 (그림 3).

그림3. 바이오의약품 개발에서의 Octet의 활용

Octet 장비로 분석한 결과물은 다양한 바이오 의약품 승인자료로 활용되고 있습니다. 대표적인 사례로, 2017년 유럽의약품청 EMA (European Medicines Agency)으로부터 승인된 immune checkpoint PD-1 억제제인 TECENTRIQ® (Roche)은 PD-L2가 아닌 PD-L1에서만 특이적으로 결합함을 Octet 결과로 증명하였고, 2015년 PD-1 억제제로 승인된 KEYTRUDA® (MSD)는 human PD-1 혹은 cynomolgus PD-1의 결합력 비교에 Octet 분석 결과가 사용되었습니다. 이와 같이 바이오 의약품개발에 있어 Octet의 활용도는 점차 증가되고 있습니다.

                      그림 4. 바이오 의약품 승인을 위해 활용된 Octet 결과 (예)

 

1. Octet 활용 기술

Octet 시스템은 분석하고자 하는 분자의 크기와 시료에 conjugation시킨 tag molecules에 따라 다양한 바이오센서를 적용하여 신약 후보물질 스크리닝 및 특성 분석 결과를 신속하게 도출할 수 있습니다.

그림 5. Octet 에서 활용 가능한 바이오센서 종류

1. 정제 / 비정제 단백질 또는 항체의 정량 (Quantitation)

• Direct (1-step) Protein 정량

단백질 시료의 농도를 결정하기 위해 표준 곡선 (standard curve)과 대비하여 시료의 결합속도를 측정하여 농도를 확인할 수 있습니다. 96개 시료에 대해 한번에 high throughput으로 정제 단계 없이 배양액상태에서 빠른 시간 안에 측정하고 분석이 가능합니다. (Biosensor: Protein A, Protein G, Protein L, Anti-hIgG, Anti-msIgG) (그림 6)

그림 6. High Throughput mAb Quantitation in Crude Culture Media

 Octet 시스템을 활용한 ELISA 분석 (Converting an ELISA Assay in an Octet Quantitation Assay)

그림 7. Octet 시스템을 활용한 ELISA 분석방법

Octet을 활용하여 ELISA 분석이 가능하며 classical ELISA 분석에 비해 다음과 같은 장점이 있습니다.

• 빠르고 쉽게 배양액 내 시료를 측정 가능하며 실시간 분석 가능.

• 모든 스텝 자동화로 실험 효율성 증대 및 결과의 실험적 오차 감소.

• 높은 감수성으로 낮은 반응 감도도 검출이 가능하여 분석 spectrum이 넓고 고감도 정량 분석이 가능

1. 정제 / 비정제 시료의 결합 친화성 측정 (Kinetics)

• 단백질-단백질 또는 수용체/리간드, 항원-항체의 결합 친화성 측정

신약 유효물질과 타겟 물질의 결합 친화력은 선도물질 선정에서 핵심요소입니다. Octet 시스템을 활용하면 분자결합 친화성, 특이성, 결합률/해리율 상수 등을 고도의 정밀성으로 고속으로 비교 분석 할 수 있습니다

그림 8. Octet Automated Workflow for Kinetics (High Throughput Kinetic Results)

• 고수율 파지 디스플레이 스크리닝

  파지 디스플레이법으로 파지가 디스플레이 되면, 펩타이드 라이브러리와 단백질 라이브러리에 대한 결합력을 비교 측정하여 고수율 스크리닝이 가능합니다. Fab 절편/ 비항체 리간드의 2차 스크리닝 플랫폼으로도 활용이 가능하며, 친화성 랭킹 데이터를 도출하여 1차 유효물질 선정에 활용할 수 있습니다.

• 

그림 9. Octet 활용 고수율 파지 디스플레이 스크리닝

 

• Fc 수용체 (Fc-gamma Receptors and FcRn) 결합 분석

Fc 수용체에 대한 결합력은 항체의 안정성과 효능에 직접적인 영향이 있고, 항체 Fc 엔지니어링을 통해 제작된 다양한 항체 Fc 변이체, Fc 융합 바이오 의약품과 수용체간의 결합력 측정을 Octet 시스템으로 분석할 수 있습니다.

그림 10. Workflow for Fc gamma Receptors Kinetic Assay on FAB Biosensor

그림 11. Analysis of pH-dependent FcRn Binding

 

• DNA Aptamer Binding 분석

크기가 매우 작은 올리고뉴클레오티드 및 펩타이드에 비오틴을 표지하여 타겟 단백질과의 결합력을 측정할 수 있습니다.

그림 12. 짧은 단일 가닥 핵산 (DNA-aptamer)과 표적 단백질 간의 결합 확인

 

1. 반응 특이성 분석

• Isotyping 분석 (Recognition of Human IgG or Mouse IgG Isotypes)

Protein A biosensor를 이용하여 기존의 ELISA를 이용한 분석보다 빠른 시간 안에 human IgG isotype을 확인할 수 있습니다. (Biosensor: Anti-Human IgG Fc, Anti-Murine Fv Quantitation Biosensor)

그림 13. Human Antibody Isotypes Binding to the Protein A Biosensor

 

• Epitope Binning Assay

같은 항원에 대한 서로 다른 항체가 타겟 단백질의 다른 epitope을 인지하는지 BLI 시스템을 활용하여 확인 할 수 있고, 관련하여 3 가지 분석 방법이 이용되고 있습니다 (그림 14). 항체와 항원의 고정 여부 및 항체의 결합 순서에 따라 적정 포맷을 이용하여 분석을 하고 있습니다.

그림 14. Assay Methods for Epitope Binning

 

1. 지원 사례 (Case Studies)   

신약개발지원센터에서는 Octet QK384 장비를 활용하여 위에서 언급한 다양한 방법으로 바이오 의약품 개발 지원을 하고 있으며, 다음과 같이 그 실시 예를 간략히 소개하고자 합니다.

1. 항원-항체의 측정 (장비활용서비스_M사) 결합 친화성

• Phage display를 통해 발굴한 항체 후보군 33종의 결합력을 high throughput으로 분석하여 최종후보군들을 선정하였습니다.

 

그림 15. 항원-항체 결합친화성 비교 분석 Ranking (예)

1. Epitope Binning Assay (장비활용서비스_M사)

• scFv 형태의 항체 후보군 32종에 대해 Epitope binning assay를 짧은 시간 내 high throughput으로 비교 분석 하여 선별하였습니다.

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그림 16. Epitope Binning 분석 (예)

 

1. Fc 수용체 결합 분석 (과기부 국가지원과제)

• 항체 Fc 변이체 후보군들과 다양한 Fc 수용체들 (Fc gamma Receptor, FcRn)과의 결합력을 비교 분석하였습니다.

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그림 17. Fc 변이체들과 다양한 Fc 수용체들과의 결합 비교 (예)

 

1. Direct Protein 정량 (과기부 국가지원과제)

• 세포주 개발 단계에서 다수의 stable cell clones으로부터 배양액 상태로 정제과정 없이 정량분석하여 시간과 비용을 절약시킨 고효율로 고발현 clones을 선별하였습니다.  

• 

그림 18. 세포주 개발단계에서 배양액 상태에서 정량 분석 (예)

 기타 사례

1. 그림 19. 기타 Octet 활용 분석 (예)

    

담당자 : 후보물질최적화팀 팀장 최소영 (043-200-9511, soyoung@kbiohealth.kr)

        후보물질최적화팀 선임연구원 손명호 (043-200-9515, sohnho2@kbiohealth.kr)

후보물질최적화팀 주임연구원 이세라 (043-200-9519, srlee@kbiohealth.kr)